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高效液相色谱法测定全血中骨碱性磷酸酶的活力

时间:2017-06-02  来源:本网  作者:admin  浏览次数:409

  30的溶液为流动相,流速为0.8mL/min,检测波长为275nm当BALP的质量浓度为8200mg/L时,其活性对峰面积呈良好的线性关系(r=ft996),检测限为3ng该方法简便、快速、可靠,可用于临床测定全血中的BALP:高效液相色谱法;骨碱性磷酸酶;全血1前言碱性磷酸酶(ALP)是广泛存在于肌体内的一组水解酶类,特别是在骨骼、肝、肾、胎盘、胆汁中含量较高肝、胆疾患,甲状腺、甲状旁腺机能亢进及某些肿瘤都可导致血清ALP升高,因此ALP常被作为临床早期较敏感的理化指标之一通常测得的血清ALP是各型ALP的总活性。由于各型ALP对外界影响因素反应不同,因而其同工酶的变化对鉴别诊断更具有特异性血清ALP活性升高多见于属于ALP次级同工酶的肝型和骨型ALP(L/BALP)41,其氨基酸顺序相同,仅糖化程度略有差别,因此ALP次级同工酶理化性质又有所差别。鉴别BALP的电泳法和非电泳法虽可将BALP与LALP完全分开,但不便于临床常规测定国外有人5,61用离子交换色谱、亲和色谱等分离和测定ALP同工酶,而国内尚未见报道。本实验结合免疫浓缩技术,采用HPLC法分析BALP活性本法不需梯度洗脱,且不受肝、胆、肠等非骨型ALP同工酶干扰,适用于血清BALP的定量分析。

  2材料与方法药品甲醇、磷酸苯二钠、磷酸均为分析纯BALP试条、稀释液(10mmol/L,pH 7.4的磷酸缓冲液)均由北京协和医药科技开发总公司研希山苯酚标准液苯酚(上海试剂三厂)蒸馏后称取000mL取上述苯酚溶液25mL用碘量法标定,得到溶液中苯酚的质量浓度为1323g/L将上述溶液用棕色瓶存于冰箱中,作为苯酚标准储备液测定原理全血在BALP试条内经血浆分离、转运、预处理,到达反应膜上,与固相亲和素发生亲和反应后被特异结合在膜上。用HPLC测其活十性实验动物2月龄的SD大鼠,体重(10(±15)g,本院动物中心提供。

  样本处理大鼠剪断尾梢,弃去第一滴血,取全血30PL加到BALP试条的加样孔里,待血液全部渗入后,加1滴稀释液(约25PL),间隔30s,再加2滴稀释液,于低温下放在一个有浸水纱布的铝饭盒中密封,4h后以试条反面吸附垫有淡黄色血浆渗出为度,剥去试条上保护膜,在蒸馏水中轻轻摆动涮洗,显露出中间反应膜,在滤纸上吸干水分,剪下反应孔,加入10PL01mol/L的磷酸缓冲液(pH10.2)、10L0.1mol/L的磷酸苯二钠试剂及80L双蒸水,混匀,于37°C水浴中准确保温5min,立即加入50PL体积分数为25%的三氯醋酸溶液,终止上述酶促反应,冰浴10min后离心(8000r/min)10min,吸取上清液10PL备用。

  计算根据酶活力单位定义,1L大鼠全血在37°C,pH10.2的条件下反应1min,催化底物生成1L产物(苯酚)所需要的酶量为一个酶活力单位血浆中酶活力计算公式为酶活力(U/L)=色谱d(CHsH),dC6OH)可根据标准苯酚的质量浓度(g/L)与峰面积的关系得到。酶反应时间为5min,每份标本全血30PL 3结果3.1线性范围与检测限取空白血样30L,加入一定量标准苯酚溶液,稀释成不同浓度的标准苯酚液,依次进行HPLC分析。在标准苯酚质量浓度为8~200mg/L范围内,以其质量浓度Y(mg/L)对平均峰面积X进行回归分析,得回归方程:Y=1. 1时,测得最低检测限为3ng 3.2样品分离效果按前述色谱条件分离全血样品(见)苯酚出峰时间为9.80min,峰形陡尖,杂质不干扰测定血清BALP活力(峰1)色谱。3回收率与精密度试验按“3.1”方法,在添加浓度下做回收试验,每个试验平行做5次,平均回收率为97.9%~98.6%.精密度测试结果见表1表1精密度试验(n=6)测定序号No.oftest酶活力平均RSD

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